В настоящей главе будут рассмотрены основные принцы, устройство, применение конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) на примере приборов фирмы Leica. Принцип КЛСМ – регистрация светового потока, исходящего из фокальной плоскости объектива при совпадении фокусов, т. е. диафрагма детектора должна быть позиционирована так, чтобы ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. В качестве источника освещения применяются лазеры и чувствительные детекторы для получения изображения.

Основная особенность КЛСМ состоит в возможности получения послойного изображения исследуемого объекта (например, клетки) с высоким разрешением и с низким уровнем шумов. Достигается это путем пошагового сканирования объекта сфокусированным пучком света от когерентного источника или столиком, использованием специфических флуоресцентных зондов и специальных методов ограничения световых потоков.

Системы сканирования в КЛСМ можно классифицировать следующим образом.

1. Сканирование лучом.

А) Зеркальные системы: однозеркальные, двухзеркальные, резонансные магнитоэлектрические.

Б) Световолоконные системы: одноволоконные, многоволоконные.

В) Сканирование объективом:

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по осям Х, Y;

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по оси Z.

Г) Акустооптические дефлекторы луча: два акустооптических дефлектора для сканирования по осям Х и Y.

Д) Дисковые системы:

· односпиральные односторонние и двухсторонние;

· многоспиральные односторонние и двухсторонние.

Е) Комбинированные системы: акустооптический дефлектор по оси Yи сканирование зеркалом по оси Х.

2. Сканирование столиком.

А) Шаговый привод: сканирующий столик с шаговыми двигателями по осям Х, Y, Z.

Б) Комбинированный привод: сканирующий столик с шаговым двигателем по осям X, Yи пьезоэлектрический привод по оси Z.

Рис. 5. Принципиальная схема работы КЛСМ.

1 - сканирующий столик; 2 - исследуемый образец; 3, 7 - объективы; 4 - сканирующее устройство; 5 - светоделительная пластина; 6 - луч света от лазера; 8, 12 - изображение точек В и С; 9 - игольчатая диафрагма; 10 - изображение точки А в центре игольчатой диафрагмы; 11 - приемник излучения; 13, 15 - свечение точек В и С, находящихся вне фокуса объектива 3; 14 - свечение точки А, находящейся в фокусе объектива 3.

Световой поток возбуждения 6 от лазерного источника поступает через светоделительную пластину 5, сканирующую систему 4 на объектив 3 и фокусируется в точку А плоскости исследуемого препарата (например, клетки), находящейся в фокусе. Полагаем, что внутриклеточные структуры связаны с флуоресцентными зондами и точку А фокусировки пучка можно рассматривать как точечный источник света, поток флуоресценции от которого через объектив 3, светоделительную пластину 5, объектив 7 фокусируется в плоскости игольчатой диафрагмы 9 ("pinhole") и регистрируется фотодетектором 11. Освещенность потоком возбуждения фрагментов препарата, лежащих вне фокуса объектива вдоль оптической оси (точки В и С), ниже, чем в точке А. Следовательно, составляющая освещенности мишени детектора от точек В и С может быть существенно уменьшена. Потоки флуоресценции, исходящие от точек В и С, лежащих вне фокуса, ограничиваются точечной диафрагмой и на детектор не попадают, либо попадает их малая часть. Таким образом, при сканировании препарата в плоскости XY детектором регистрируется сигнал, уровень которого определяется расстоянием от плоскости сканирования вдоль координаты Z. Совмещение фокуса объектива 3 с плоскостью сканирования и фокуса объектива 7 с игольчатой диафрагмой отражено в термине "конфокальность". Пошаговое перемещение плоскости сканирования вдоль оси Z позволяет получить серию контрастных послойных изображений и реконструировать внутреннюю трехмерную структуру (3-D) исследуемого объекта. Качество изображения, разрешение в плоскости XY и вдоль оси Z зависит от качества оптики, качества сканирующих систем, размеров и точности изготовления точечной диафрагмы, жесткости конструкции, эффективности используемых алгоритмов обработки сигналов, специфичности флуоресцентных зондов.

Для определения пространственной разрешающей способности микроскопа проводят анализ изображения точечного источника света. Изображение точечного источника, формируемое обычной линзой, представляет собой дифракционное пятно Эри, состоящее из яркого центрального ядра и более слабых внешних колец.

Рис. 6. Дифракционное пятно Эри.

Два точечных источника одинаковой яркости, расстояние между которыми равно d, видны как две различные точки, если расстояние между центрами кружков Эри превышает следующее значение:

r A = XY =0,6 λ/NA,

где r A - радиус первого темного кольца в кружке Эри, λ- длинна волны источника света в нм, NA – числовая апертура.

Это выражение называют критерием Рэлея. Оно определяет разрешающую способность микроскопа в плоскости образца (XY). При этом предел разрешения определяется прежде всего волновой природой света, и поэтому его часто упрощают, считая NA=1. В КЛСМ формирования изображения приводит к небольшому уменьшению размера пятна Эри. Интенсивность пятна Эри для стандартного микроскопа уменьшается по закону n -2 ,где n - поперечное смещение, а для КЛСМ интенсивность уменьшается как n -4 . Это приводит к увеличению разрешающей способности КЛСМ в 1,5 раза. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

XY c r =0,4 λ/NA,

где XY c r – разрешающая способность КЛСМ.

Для оценки преимущества КЛСМ, рассмотрим аппаратную функцию (структуру пятна Эри) и проанализируем разрешающую способность микроскопа в осевом направлении (Z). Трехмерное пятно Эри (распределение интенсивности), является трехмерной аппаратной функцией (ТАФ) которая определяет изображение объекта. ТАФ для обычного микроскопа имеет коническую форму, расширяющуюся вверх и вниз от центра, тогда как для конфокального микроскопа она имеет эллиптическую форму и менее вытянута в осевом направлении.

Рис. 7. Вид трехмерной аппаратной функции точечного источника обычного микроскопа – (а) и КЛСМ – (б).

Критерий Рэлея применим и для определения разрешающей способности микроскопа в направлении оптической оси. Для обычного микроскопа два точечных источника, расположенные на некотором расстоянии вдоль оптической оси, можно разрешить, если максимумы их пятен Эри находятся на расстоянии:

Z r =2 λ/NA 2 ,

где Z r - осевая разрешающая способность микроскопа.

Распределение энергии в пятне Эри для КЛСМ более узкое, и разрешающая способность в осевом направлении в 1,4 раза выше. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

Z r c =1,4 λ/NA 2 ,

где Z r c - осевая разрешающая способность КЛСМ.

Современные КЛСМ имеют одно главное преимущество - возможность получения тонких оптических срезов. На качество изображения при получении тонких оптических срезов влияют следующие параметры:

· размер конфокальной диафрагмы;

· числовая апертура объектива NA;

· показатель преломления;

· поглощение света в образце.

Уменьшение интенсивности света по мере увеличения толщины образца влияет на разрешение микроскопа по оптической оси Z. Разрешение зависит от оптики микроскопа и образца. Толщину оптического сечения в конфокальном микроскопе обычно характеризуют шириной распределения на полувысоте пика интенсивности ∆z 1/2 = 0,65мкм. Если образец и детектор идеальны, этот параметр зависит от числовой апертуры объектива, длины волны λ и показателя преломления иммерсионной среды n i .

Рис. 8. Зависимость осевой разрешающей способности микроскопа ∆z 1/2 от числовой апертуры объектива.

В КЛСМ перед детектором ставится регулируемая диафрагма, изменяющая количество света. Игольчатые диафрагмы предназначены для создания условий максимальной или полной фильтрации света, попадающего в плоскость формирования изображения от точек, не совпадающих с фокальной плоскостью или находящихся рядом с анализируемым элементом объекта в фокальной плоскости. Размер игольчатой диафрагмы конечен, и от него зависят поперечное разрешение прибора, яркость освещенных элементов препарата, смещенных относительно фокальной плоскости по оси Z, и глубина резкости. Размер диафрагмы влияет на толщину получаемого сечения. Чем меньше диафрагма, тем ближе толщина сечения к теоретическому пределу (шириной распределения на полувысоте пика интенсивности), а при очень больших апертурах способность получать тонкое сечение становится невозможным.

Как говорилось ранее, КЛСМ дает возможность получать оптическое сечение на значительной глубине от поверхности образца, при этом важным моментом является показатель преломления и проблема глубины. Прохождение падающего и отраженного луча через образец влияет на качество изображения. Если показатели преломления иммерсионной среды и образца близки (влияние разности показателей преломления иммерсионной жидкости и объекта на появление рассеянного света, снижающего контраст изображения и действующего как эффект сферической аберрации), световой конус будет сходиться. Если же показатели преломления различаются, появляется сферическая аберрация.

Рис. 9. Показатели преломления иммерсионной среды и образца.

а – формирование изображения иммерсионным объективом без аберрации; б – сферическая аберрация, обусловленная несоответствием показателей.

При разных показателях преломления световые лучи, идущие на различном расстоянии от оптической оси, в одну точку не фокусируется, что приводит к потере качества изображения. По возможности показатели преломления образца и объектива должны быть согласованы. Если показатели преломления образца и иммерсионной среды различаются, изображение объекта на глубине размыто вдоль оптической оси, а плоскость фокуса сдвинута. Для увеличения глубины проникновения объектив должен иметь большую числовую апертуру, например иммерсионный объектив. Однако такие объективы имеют малое максимальное расстояние от линзы объектива до фокальной плоскости. На глубину проникновения влияет неоднородность образца, которая приводит к снижению интенсивности света на большой глубине и появлению тени. В идеале образец, позволяющий достичь максимальной глубины проникновения и максимального разрешения, должен иметь показатель преломления, равный показателю преломления объектива, но это однородный образец, а таких биологических образцов не существует.

Во время сканирования КЛСМ получает ряд оптических сечений с регулярно возрастающей глубиной от поверхности образца. Для большинства КЛСМ получение сотни 2D-изображений занимает всего несколько минут. Оптическое изображение можно получить двумя способами:

1) получение последовательности оптических сечений в плоскости XY, расположенных на расстоянии ∆z друг от друга. Сопоставление координат центров объектов в различных сечениях дает возможность определить их ориентацию и распределение по длине.

Рис. 10. Изучение трехмерной структуры в плоскости XY.

2) получение ряда оптических сечений в плоскости XZ, расположенных на расстоянии ∆y. Если образец параллелен плоскости сечения, то его сечение в плоскости XZ будет почти круглым, при сопоставлении изображений в различных XZ сечениях, можно определить изогнутость исследуемого объекта.

Рис. 11. Изучение трехмерной структуры в плоскости XZ.

Трехмерная реконструкция исследуемых объектов методами КЛСМ направлена на решение двух задач:

· визуализации объемного изображения объекта, полученного путем "сборки" его оптических срезов;

· количественного анализа внутренних структур объекта.

На сегодняшний день существует достаточно много фирм производителей КЛСМ. Инновации фирм-производителей КЛСМ:

· 2002 г. фирма Leica анонсировала акустооптический светоделитель (AOBS), позволяющий эффективно разделять лазерный луч возбуждения и люминесценцию;

· 2002 г. фирма Carl Zeiss начала выпускать конфокальный микроскоп LSM 510 META с оригинальным фотоприемником, регистрирующим сигнал одновременно в 32-х спектральных каналах;

· 2004 г. Zeiss создает высокоскоростной LSM 5 Live, имеющий скорость сканирования в 20 раз выше обычного КЛСМ;

· Фирма Olympus разработала прибор с двумя сканерами, позволяющий более эффективно применять, например, методику FRAP;

· Nikon - создает компактный и недорогой КЛСМ упрощенной конструкции;

· 2007 год фимра Leica объявила о выпуске 4Pi-конфокального микроскоп, улучшающий аксиальное разрешение в 4 - 7 раз.

Рассмотрим устройство КЛСМ относящегося к новому более совершенному поколению приборов – TCS SP5 фирмы Leica.

Рис. 12. Многофотонная/конфокальная широкополосная система TCS SP5 (инвертированный микроскоп).

Ключевые элементы КЛСМ TCS SP5: AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр, AOBS – акусто-оптический светоделитель, SP-Detector – датчик спектрального фотометра.

AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр – служит для минимизации оптического экспонирования, настраивает мощность лазера в зависимости от образца и флуорохрома. Позволяет выбрать необходимую длину волны и управлять интенсивностью света возбуждения. AOTF - представляет собой электрически перестраиваемый фильтр, работающий на принципе объемной дифракции светового пучка на неоднородностях показателя преломления. Такие неоднородности возникают при возбуждении в двулучепреломляющих кристаллах ультразвуковой акустической волны. При анизотропной дифракции в одноосных кристаллах существует минимальная частота ультразвука, при которой углы падения и дифракции совпадают, и происходит так называемое коллинеарное акустооптическое взаимодействие.

Рис. 13. Акустико-оптический настраиваемый фильтр.

AOBS – акусто - оптический светоделитель, это акусто-оптический кристалл – настраиваемое преломляющее устройство, работающее в реверсивном режиме. Что дает использование AOBS:

1. Для получения четкого, с низким уровнем шума, изображения необходима высокая степень светопропускания. Уменьшение же шума за счет усреднения изображения по многим последовательным сканированиям с необходимостью приводит к фотообесцвечиванию изучаемого объекта. Степень светопропускания AOBS превосходит большинство дихроичных зеркал во всем видимом диапазоне спектра. Следовательно, требуется усреднение по меньшему числу сканирования. В результате препарат просуществует гораздо дольше;

2. Яркие и четкие изображения требуют прохождения как можно большего числа фотонов от объекта к детектору, что улучшает качество изображения. AOBS обеспечивает регистрацию максимально широких полос флуоресценции, то есть максимального числа фотонов;

3. Низкое обесцвечивание во время получения изображения важно для защиты образца от выцветания, а живых объектов от токсичных продуктов фотолиза флуорохромов. Кривые светопропускания AOBS имеют очень крутые наклоны, что позволяет регистрировать флуоресценцию флуорохрома максимально близко к полосе его возбуждения;

4. Может быть возбужден любой краситель видимого диапазона, так как отражение может настраиваться индивидуально;

5. Решен вопрос многопараметрической флуоресценции: можно запрограммировать до восьми линий излучения лазера, оставляя достаточно места для регистрации флуоресценции, при этом частоты настраиваются;

6. Соотношение красителей, как соотношение возбуждения метаболит - проб, например, для Са 2+ , мембранного потенциала, водородного показателя должно быстро переключаться при последовательном сканировании. AOBS переключается за несколько микросекунд;

7. Регистрация изображения в отраженном свете - еще одна возможность использования. AOBS позволяет настраивать прохождение отраженного возбуждающего света индивидуально;

8. Сканирование ROI (последовательное сканирование и сканирование определенной зоны) также улучшено: различные режимы возбуждения применимы для различных областей во время отдельного сканирования;

9. Большой объем 3D записей, в последовательном режиме выигрывает от устройств с быстрым переключением, так как скорость увеличивает эффективность системы;

10. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) требует низкого фона и малого светорассеяния Только AOBS эффективно блокирует близкие линии излучения, например, от Аr лазеров;

11. Спектральная запись (Лямбда сканирование) обеспечивает точный спектр, так как светопропускание AOBS «белое», а это значит, что он не вносит изменений в спектр испускания - что является обычной проблемой при выполнении спектрального сканирования в системе с дихроичными зеркалами;

12. Для истинного конфокального получения оптических срезов необходимо точечное освещение и точечная регистрация флуоресценции. AOBS подходит для работы с конфокальными устройствами точечного сканирования;

13. Получение изображения в мультифотонном режиме либо при ультрафиолетовом возбуждении может быть выполнено параллельно без ошибок или ограничений. AOBS не меняет возбуждение лазеров невидимого диапазона и не меняет спектр флуоресценции;

14. Невозможно выполнить ошибочную операцию, так как AOBS контролируется совместно с управлением возбуждения при помощи AOTF (акустико-оптический настраиваемый фильтр). Если выбрана линия возбуждения, то и AOBS запрограммирован в соответствии с ней. Оператору не надо принимать решения - работа выполняется правильно и автоматически;

15. Отсутствует разюстировка, так как нет подвижных элементов присущих фильтровым барабанам и слайдерам. Кристалл прочно установлен, программирование выполняется электронным способом;

16. Нет необходимости в дорогостоящем дополнительном оборудовании, например, фильтровых кубиков, слайдеров дихроичных зеркал и т.д. Поэтому гораздо меньше расходы на техническую помощь для установки новых оптических элементов.

Рис. 14. AOBS – акусто - оптический светоделитель.

SP-Detector – датчик спектрального фотометра. Свет от образца, являющийся суммой спектров вызванной флуоресценции проходит pinhole диафрагму, которая формирует конфокальный оптический срез. Далее при помощи призмы этот свет раскладывается в спектр. При прохождении первого детектора, свет проходит устройство щелевого фотометра, состоящего из двух шторок с приводом. Эти шторки обрезают края спектра с обеих сторон диапазона и направляют к сенсорам 2 и 3 порядка. В итоге спектр раскладывается одновременно на пять каналов. В итоге при использовании SP – детектора регистрируется излучение от различных красителей в образце.

Рис. 15. Спектральный детектор SP.

SP – детектор позволяет производить лямбда-сканирование: спектральные изображения накапливаются для анализа характеристик красителей, задействованных в эксперименте, сразу.

Введение.

Конфокальный микроскоп отличается от "классического" оптического микроскопа (см. ) тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой (красные лучи на рис. 1б ), проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек (например, синие лучи на рис. 1б ) в основном задерживается диафрагмой. Вторая особенность состоит в том, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку (рис. 1в) . Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом (рис. 1г) . Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Рис. 1а. Ход лучей в обычном оптическом микроскопе, когда в фотоприемное устройство попадает свет из различных точек образца.

Рис. 1б. Применение диафрагмы позволяет существенно снизить фоновую подсветку от точек образца вне анализируемой области.

Рис. 1в. Дополнительное повышение контраста достигается применением подсветки, фокусирующей свет в анализируемую точку.

Рис. 1г. Схема со светоделительной пластинкой упрощает конструкцию микроскопа и процесс юстировки за счет двойного использования объектива
(для подсветки и сбора отраженного сигнала).

Разрешение и контрастность в конфокальном микроскопе.

Рассмотрим теперь математически, каким образом и насколько количественно изменяется контрастность при применении конфокальной микроскопии. Во-первых, так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки (далее обозначаемая PSF, см. определение в ) имеет вид

Для качественного понимания удобно рассматривать каждую PSF как вероятность того, что фотон попадет в точку с координатами , либо что фотон будет зарегистрирован из точки с координатами , тогда конфокальная PSF есть произведение независимых вероятностей. На рис. 2 приведено изображение обычной PSF и конфокальной PSF.

Рис. 2. Конфокальная PSF показана справа, а обычная PSF – слева .

Если использовать критерий Релея для разрешения (провал 26% от максимума распределения), то мы получим, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но не существенно. Для конфокального микроскопа

в то время как для обычного микроскопа

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности для обычной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0.04%. На рис. 3 приведен практический пример, когда это важно. На верхней части рисунка мы видим, что тусклый объект (интенсивность в 200 раз меньше, чем у яркого) не возможно обнаружить в обычный микроскоп, хотя расстояние между объектами существенно больше того, что предписано критерием Релея. В то же самое время, в конфокальный микроскоп (нижняя часть рисунка 3) данный объект должен хорошо регистрироваться.

Рис. 3. Распределение интенсивности для случая обычного микроскопа (верхний рисунок) и конфокального микроскопа (нижний рисунок).
Максимум интенсивности тусклого объекта в 200 раз меньше, чем интенсивность яркого [1 ].

Распределение интенсивности вдоль оптической оси для конфокального микроскопа определяется выражением

Тогда пользуясь критерием Релея получим разрешение вдоль оптической оси

Здесь важно отметить, что не следует путать разрешение вдоль оптической оси и глубину фокуса в обычном микроскопе. Обычно глубина фокуса в сотни раз превышает разрешение вдоль оптической оси.

Влияние диафрагмы в фокальной плоскости.

Один из параметров, который никак не фигурировал в данном выше описании - это размер диафрагм в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз. Отметим, что при анализе мы молчаливо предполагали источник точечным и именно в этом предположении получили функцию размытия точки (PSF) для обычного и конфокального микроскопа. Полученные PSF описывают свойства объективной линзы, а изображение диафрагмы в плоскости объекта определяет, свет из каких областей регистрируется фотодетектором. Очевидно, однако, что уменьшение размера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходящего света, увеличивает уровень шума и, в конечном итоге, может свести на нет все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, стоит вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.

Диафрагма с отверстием меньше размера пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разрешение. Диафрагма размером в одно пятно Эйри позволяет по максимуму использовать разрешающую способность объективной линзы. Однако размер диафрагмы примерно в 3-5 раза больше пятна Эйри представляется наиболее подходящим компромиссом. Следует понимать, что обсуждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от увеличения линзы. В частности, при использовании 100-кратной линзы диафрагма с отверстием 1 мм будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.

Для того, чтобы учесть наличие диафрагмы математически и построить новую функцию распределения интенсивности, следует выполнить свертку

а для конфокального микроскопа уже полученную функцию умножать на . Результирующее распределение интенсивности для случая диафрагмы с размером 5 пятен Эйри приведено на рис. 4 .

Люминесцентная, или флюоресцентная, микроскопия - метод гистологического анализа с помощью люминесцентного микроскопа, в котором используется явление люминесценции (свечения) веществ при действии на них коротковолновых лучей (ультрафиолетового света, рентгеновских лучей). Некоторые биологические соединения, присутствующие в клетках, характеризуются спонтанной флюоресценцией при попадании на клетку ультрафиолетовых лучей. Для выявления же большинства других соединений клетки обрабатываются специальными флюорохромами (флюо-ресцеином, акридином оранжевым, корифосфином). С помощью флюорохромов исследуют, например, содержание в клетках нуклеиновых кислот. При окраске акридином ДНК дает красно-зеленое свечение, а РНК - оранжевое.

Люминесцентный микроскоп широко используется также для изучения иммунофлюоресценции. Иммунофлюоресценция позволяет исследовать в клетке содержание очень малых количеств белка. Препарат предварительно обрабатывают антителами к исследуемому белку, меченными флюоресцирующим красителем.

Ультрафиолетовая микроскопия - метод изучения клеток с помощью микроскопов, в которых для освещения объекта используют ультрафиолетовые лучи (длина волны которых равна 210-275 нм). Такие микроскопы имеют большую, чем обычные световые микроскопы, разрешающую способность. Для наблюдения за объектом требуется специальная аппаратура - электронно-оптический преобразователь, который предохраняет орган зрения от действия ультрафиолетовых лучей.

Электронная микроскопия . В электронных микроскопах используют пучок электронов, длина электромагнитной волны которых в 100 000 раз короче длины волны видимого света. Разрешающая способность электронного микроскопа в сотни и тысячи раз превышает обычные оптические приборы и равна 0,5-1 нм, а современные мегавольтные электронные микроскопы дают увеличение до 1 000 000 раз. С помощью электронных микроскопов получены многочисленные данные об ультраструктуре клеток. Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), при которой изучаются поверхностные структуры клеток.

Цитоспектрофотометрия - метод изучения химического состава клетки, основанный на избирательном поглощении теми или иными веществами лучей с определенной длиной волны. По интенсивности поглощения света, которая зависит от концентрации вещества, производится количественное определения его содержания в клетке.

Радиоавтография - важный информативный метод, позволяющий изучать распределение в клетках и тканях веществ, в состав которых искусственно введены радиоактивные изотопы (3Н, НС, 32Р и др.). Введенный в организм животного (или в среду культивирования клеток) изотоп включается в соответствующие структуры (например, меченый тимидин - в ядра клеток, синтезирующих ДНК). Метод основан на способности включенных в клетки изотопов восстанавливать бромистое серебро фотоэмульсии, которой покрывают срезы ткани или клетки. Образующиеся после проявления фотоэмульсии зерна серебра (треки) служат своего рода автографами, по локализации которых судят о включении в клетку примененных веществ. Применение меченных тритием предшественников нуклеиновых кислот (тимидина, аденина, цитидина, уридина) позволило выяснить многие важные аспекты синтеза ДНК, РНК и клеточных белков.

Гисто- и иммуноцитохимические методы . В их основе лежит применение химических реакций для выявления распределения химических веществ в структурах клеток, тканей и органов. Современные гистохимические методы позволяют обнаруживать аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, различные виды углеводов, липидов и др. Для выявления специфических белков используют иммуноцитохимические реакции. Для этого получают специфические сыворотки, содержащие антитела (например, против белка микротрубочек - тубулина). Далее химическим путем соединяют эти антитела с флюорохромом (или другим маркером). Если меченые антитела нанести на гистологический срез, они вступают в соединение с соответствующими белками клетки и возникает специфическое свечение, видимое в люминесцентном микроскопе. Современные иммуноцитохимические методы, помимо флюорохромов, используют другие самые разнообразные специфические маркеры, позволяющие качественно и количественно оценивать содержание в клетке исследуемых соединений. Модификацией рассматриваемого метода является введение меченых антител в цитоплазму живых клеток с помощью микроманипуляторов.

Метод культуры клеток , тканей заключается в выращивании клеток и тканей вне организма в искусственных питательных средах (в условиях in vitro). Для получения изолированных клеток производят предварительную обработку материала ферментами трипсином или коллагеназой. Метод позволяет изучать реакции клеток на различные воздействия, механизмы регуляции пролиферации, дифференцировки и гибели. Особенно важное значение данный метод имеет для эмбриологических и цитофизиологических исследований, а также для трансплантации эмбриональных клеток при лечении врожденных и приобретенных дефектов обмена веществ.

Микроскопическая хирургия клетки - совокупность методических приемов, осуществляемых с помощью специального прибора - микроманипулятора. Этот прибор позволяет производить различного рода тончайшие операции на клетке (введение веществ, удаление или пересадка структурных компонентов клетки, нанесение уколов, разрезов и пр.) и нашел широкое применение в эмбриологии.

Цейтрафферная, или замедленная , микрокино- или видеосъемка - изучение живых клеток. Такой способ позволяет проследить за медленно протекающими изменениями клеток.

Метод фракционирования (дифференциального центрифугирования) клеток. Его суть заключается в получении из клеток изолированных структурных компонентов. Основан на разных скоростях осаждения этих компонентов при вращении гомогенатов клеток в ультрацентрифугах. Данный метод сыграл и играет очень важную роль в изучении химического состава и функциональных свойств субклеточных элементов - прежде всего, органелл.

Конфокальная микроскопия - современный метод, использующий в качестве осветителя лазерный луч, который последовательно сканирует всю толщину препарата. Информация о плотности объекта по каждой линии сканирования передается в компьютер, где специальная программа осуществляет трехмерную реконструкцию исследуемого объекта.

Основная концепция

Конфокальный принцип точка датчика из патента Минсков

Принцип конфокальной микроскопии был запатентован в 1957 году Марвин Мински и стремится преодолеть некоторые ограничения традиционных широкоугольных микроскопов флуоресценции . В обычном (т.е. широкого поля) флуоресцентный микроскоп , весь образец затопляются равномерно свет от источника света. Все части образца в оптическом пути возбуждаются в то же время и в результате флуоресценции детектируют с помощью микроскопа фотодетектора или камер , включая большую несфокусированный фон часть. В противоположность этому, конфокальный микроскоп использует точку подсветки (см функция рассеяния точки) и крошечное отверстие в оптически сопряженной плоскости в передней части детектора, чтобы исключить из фокуса сигнала - название «конфокальной» происходит от этой конфигурации. Как только свет, излучаемый с помощью флуоресценции очень близко к фокальной плоскости можно обнаружить, изображение в оптическом разрешении , в частности, в направлении глубины образца, гораздо лучше, чем у широкого поле микроскопов. Тем не менее, так как большая часть света от образца флуоресценции блокируется на прокол, это повышенное разрешение за счет уменьшенной интенсивности сигнала - так долго воздействия часто требуются. Чтобы компенсировать это падение сигнала после того, как прокол , интенсивность света обнаруживается с помощью чувствительного детектора, как правило, фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) или лавинным фотодиодом , превращая светового сигнала в электрический, который записывается с помощью компьютера.

Как только одна точка в образце освещена в то время, 2D или 3D изображений требуется сканирование над регулярной растра (т.е., прямоугольный шаблон параллельных линий сканирования) в образце. Луч сканируют поперек образца в горизонтальной плоскости с помощью одного или более (серво контролируется) осциллирующие зеркала. Этот метод сканирования, как правило, имеет низкую реакционную задержку и скорость сканирования может изменяться. Медленное сканирование обеспечивают лучшее отношение сигнал-шум , что приводит к лучшей контрастности и более высоким разрешением.

Достижима толщина фокальной плоскости определяется главным образом от длины волны используемого света, деленной на числовой апертуры этого объектива , но и оптических свойств образца. Тонкие оптические секционирования возможно делают эти типы микроскопов особенно хороши в 3D визуализации и профилировании поверхности образцов.

Последовательные срезы составляют «Z-стек», который может быть либо обработан определенным программным обеспечением для создания 3D-изображения, или он объединяется в 2D стеку (преимущественно максимальная интенсивность пикселя берутся, другие общие методы включают использование стандартного отклонения или суммирования пикселей).

Конфокальная микроскопия обеспечивает емкость для прямого, неинвазивного, серийного оптического секционирования интактных, толстых и живых особей с минимумом подготовки проб, а также незначительным улучшением в боковом разрешении. Биологические образцы часто обрабатывает флуоресцентные красители , чтобы сделать выбранные объекты видимыми. Однако, фактическая концентрация красителя может быть низкой, чтобы свести к минимуму нарушения биологических систем: некоторые инструменты могут отслеживать отдельные молекулы флуоресцентных. Кроме того, трансгенные методы могут создавать организмы, которые производят свои собственные флуоресцентные молекулы химерных (такие как сплав GFP, зеленого флуоресцентного белка с представляющим интерес белком). Конфокальные микроскопы работают по принципу точечного возбуждения в образце (дифракции ограничено точечные) и обнаружение точки результирующего сигнала флуоресцентного. Обскуры на детекторе обеспечивает физический барьер, который блокирует вне фокуса флуоресценции. Только в фокусе, или центрального пятна диска Эйри, записывается. Растровое сканирование образца в одной точке, в то время допускает тонкие оптические участки должны быть собраны путем простого изменения Z-фокус. Полученные изображения могут быть сложены, чтобы произвести 3D - изображение образца.

Методы, используемые для горизонтального сканирования

Четыре типа конфокальных микроскопов являются коммерчески доступным:

Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы использовать несколько зеркала (обычно 2 или 3 сканирований линейно вдоль осей х и у-ось) для сканирования лазера на образец и «descan» изображения через фиксированную обскуру и детектор.

Пользы

CLSM широко используется во многих биологических научных дисциплин, от клеточной биологии и генетики в области микробиологии и биологии развития . Он также используется в квантовой оптики и нано-кристаллической визуализации и спектроскопии.

Биологии и медицины

Пример стопки конфокальной микроскопии изображений, показывающих распределение актиновых филаментов по всей клетке.

Клинический, КЛСМ используется при оценке различных глазных заболеваний, и особенно полезно для получения изображений, качественного анализа и количественной оценки эндотелиальных клеток в роговице . Он используется для локализации и идентификации присутствия нитевидных элементов грибов в роговичной стромы в случаях keratomycosis , что позволяет быстро поставить диагноз и тем самым раннее учреждение окончательной терапии. Исследование методов CLSM для эндоскопических процедур (эндомикроскопия) также показывает обещание. В фармацевтической промышленности, было рекомендовано, чтобы следить за процессом изготовления тонких фармацевтических форм пленки, чтобы контролировать качество и однородность распределения лекарственного средства.

Оптика и кристаллография

CLSM используется в качестве механизма поиска данных в некоторых оптическом хранении данных 3D - системах и помог определить возраст папируса Магдалины .

Варианты и усовершенствование

Улучшение осевого разрешения

Точка распространение функция точечного эллипсоид, несколько раз до тех пор, как это широко. Это ограничивает осевое разрешение микроскопа. Один из методов преодоления этого 4 π микроскопии , где падающий и излучаемый свет или могут мешать как сверху, так и снизу образца, чтобы уменьшить объем эллипсоида. Альтернативная методика конфокальной микроскопии тета . В этой технике конус осветительного света и детектируемый свет расположен под углом друг к другу (наилучшим результатам, когда они перпендикулярны). Пересечение двух форы функций дает гораздо меньший эффективный объем образца. Из этого эволюционировали одного самолета подсветки микроскопа . Дополнительно деконволюции могут быть использованы с использованием экспериментально полученной функции рассеяния точки , чтобы удалить из фокуса света, улучшая контраст в обеих осевых и боковых плоскостях.

Супер разрешение

Есть конфокальной варианты, которые достигают разрешения ниже дифракционного предела, такие как стимулированной эмиссии обедненной микроскопии (STED). Кроме этой техники широкое разнообразие других методов (не конфокальной основе) супер-разрешением доступны как пальмовое, (д) ШТОРМОВАЯ, SIM - карты, и так далее. Все они имеют свои преимущества, такие как простота использования, разрешение и необходимость специального оборудования, буфера или флуорофору.

Низкотемпературный Работоспособность

Для образцов изображений при низких температурах, два основных подхода были использованы, как на основе лазерной сканирующей конфокальной микроскопии архитектуры. Один из подходов заключается в использовании непрерывного потока криостат : только образец находится при низкой температуре и ее оптической адресацией через прозрачное окно. Другой возможный подход заключается в части оптики (особенно объективного микроскопа) в криогенном сосуде Дьюара для хранения . Этот второй подход, хотя и более громоздким, гарантирует лучшую механическую стабильность и позволяет избежать потерь из - за окна.

Изображений

Частичный профиль поверхности монеты 1-Евро, измеренная с помощью диска Нипкова конфокальной микроскопии.

Отражение данных для 1-монеты евро.

история

Начало: 1940-1957

Первый конфокальный сканирующий микроскоп был построен Marvin Минсков в 1955 и патент была подана в 1957 году сканирование точки освещения в фокальной плоскости была достигнута путем перемещения стадии. Ни одно научное издание представлено не было, и никакие изображения, сделанные с ним не были сохранены.

Тандем-сканирующий микроскоп

Схема Тандем-сканирующей микроскопии Petran в. Красный бар добавлен, чтобы указать Нипкова-диск.

В 1960 году чехословацкий Моймир Petran медицинский факультет Карлова университета в Пльзене разработала Тандем сканирующая микроскоп, первый Коммерциализированный конфокальной микроскопии. Он был продан небольшой компании в Чехословакии и в Соединенных Штатах Tracor-Северной (позже NORAN) и используется вращающийся диск Нипкова , чтобы генерировать множественные возбуждения и эмиссии микроотверстий.

Патент чехословацкий был подан в 1966 году по Petran и Милан Hadravský, чехословацкого коллеги. Первая научная публикация с данными и изображениями, полученных с этим микроскопом была опубликована в журнале Science в 1967 году, автором которого является М. Дэвид Эггер из Йельского университета и Petran. В примечании к этой статье упоминается, что Petran разработан микроскоп и руководил его строительством, и что он был, частично, «научный сотрудник» в Йельском университете. Второе издание с 1968 описал теорию и технические детали прибора и имел Hadravský и Роберт Галамбос , руководитель группы в Йельском университете, в качестве дополнительных авторов. В 1970 году был выдан патент США. Он был подан в 1967 году.

1969: Первый конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

В 1969 и 1971 годах, М. Дэвид Egger и Пол Davidovits из Йельского университета , опубликовал две статьи, описывающие первый конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Это была точка сканера, то есть только один освещение пятна был сгенерирован. Он используется эпи-освещение-отражение микроскопии для наблюдения нервной ткани. В 5 мВт гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм свет отражался от полупрозрачного зеркала в направлении цели. Цель была простой объектив с фокусным расстоянием 8,5 мм. В отличии от всех предыдущих и наиболее поздних систем, образец сканировали движением этой линзы (цель сканирования), что приводит к перемещению фокальной точки. Отраженный свет вернулся к полупрозрачный зеркалу, передаваемая часть была ориентирована другой линза на точечным обнаружение, за которой фотоэлектронный умножитель был помещен. Сигнал визуализировали с помощью ЭЛТ осциллографа, электронно - лучевой был перенесен одновременно с целью. Специальное устройство позволило сделать Polaroid фотографии , три из которых были показаны в 1971 публикации.

Авторы размышляют о флуоресцентных красителях для исследований в естественных условиях. Они ссылаются на патент Минского, спасибо Стив Бэра, в то время докторант в Альберта Эйнштейна школы медицины в Нью - Йорке , где он разработал конфокальной линии сканирующего микроскопа, предложившего использовать лазер с «микроскопом Мински» и поблагодарить Галамбос, Hadravsky и Petran для дискуссий, ведущих к развитию своего микроскопа. Мотивация для их развития было то, что в Tandem-сканирующей микроскопии только фракция 10 -7 освещающего света участвует в генерации изображения в части глаза. Таким образом, качество изображения не было достаточным для большинства биологических исследований.

1977-1985: Точечные сканеры с лазерами и сканирования сцены

В 1977 году Колин JR Sheppard и Tony Wilson описал конфокальной с эпи-лазера-подсветкой, сканирование стадии и фотоэлектронных умножителей как детекторы. Этап мог перемещаться вдоль оптической оси (Z-ось), что позволяет оптические серийные срезы.

В 1979 году Фред Brakenhoff и его коллеги показали, что теоретические преимущества оптического секционирования и улучшения разрешения действительно достижимо на практике. В 1985 году эта группа стала первой публиковать убедительные снимки, сделанные на конфокальной микроскопии, которые были в состоянии ответить на биологические вопросы. Вскоре после того, как много больше групп начали использовать конфокальной микроскопии, чтобы ответить на научные вопросы, которые до сих пор осталось загадкой из - за технологических ограничений.

В 1983 IJ Cox унд С. Шеппард из Оксфорда опубликовал первую работу в соответствии с которым конфокальный микроскоп, управляемый компьютером. Первый коммерческий лазерный сканирующий микроскоп, этап-сканер SOM-25 был предложен Oxford оптоэлектроники (после нескольких TAKE-кадром, приобретенных BioRad), начиная с 1982 г. Она была основана на конструкции группы Oxford.

Начиная с 1985: Лазерная точка сканеры с сканированием луча

В середине 1980-х годов, Уильям Брэдшоу Амоса и Джона Грэма Уайта и его коллег, работающих в лаборатории молекулярной биологии в Кембридже была построена первая конфокальной луча сканирующего микроскопа. Стадии с образцом не движется, вместо того, чтобы освещенность пятно, что позволяет быстрее получения изображений: четыре изображения в секунду с 512 строк каждая. Сильно преувеличены промежуточные изображения, из - за путем луча длиной 1-2 метров, допускается использование обычной ирисовой диафрагмы как «обскура», с диаметром ~ 1 мм. Первые микрофотографии были приняты при длительном воздействии на пленку, прежде чем был добавлен цифровой фотоаппарат. Дальнейшее усовершенствование позволило масштабирование в подготовку в первый раз. Цейсс примерно в то же время привели к коммерческому CLSM распространяемого шведской компании Зарастро~d. Предприятие было приобретено в 1990 году молекулярной динамики, но в конце концов CLSM прекращено. В Германии, Heidelberg Instruments , основанная в 1984 году, разработал КЛСМ, который был первоначально означало для промышленного применения, а не биологии. Этот документ был передан в 1990 году Leica Lasertechnik . Цейсс уже не-конфокальной летающего пятна лазерного сканирующего микроскопа на рынке, который был повышен до конфокальной. В докладе 1990 года, отметив, «некоторые» производитель confocals списков: Sarastro, технический инструмент, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-северного и Цейс.

В 1989 году Фриц Карл Preikschat , с сыном Ekhard Preikschat, изобрел сканирующий лазерный диод микроскоп для анализа размера частиц. Он и Ekhard Preikschat соучредителем Lasentec коммерциализировать. В 2001 году Lasentec был приобретен Mettler Toledo (NYSE: МПД). Около десяти тысяч систем были установлены по всему миру, в основном в фармацевтической промышленности для обеспечения контроля в месте процесса кристаллизации в больших системах очистки.

• Двухфотонное возбуждение микроскопия : Несмотря на то, что они используют соответствующую технологию (оба лазерные сканирующие микроскопы), многофотонные флуоресцентные микроскопы не являются строго конфокальными микроскопами. Термин конфокальной возникает из - за наличия диафрагмы в конъюгированной фокальной плоскости (конфокального). Эта диафрагма обычно отсутствует в многофотонных микроскопах.
• Полное внутреннее отражение флуоресцентный микроскоп (TIRF) о
  конфокальной микроскопии
  • Виртуальный CLSM (Java-основе)
  • анимация и разъяснение по различным типам микроскопов, включая флуоресцентные и конфокальные микроскопы . (Université Paris Sud)